RENJIEBIO:導(dǎo)致ELISA實驗假陽性的5大因素

 ELISA法對IgG、IgM都有很好的檢測能力，因其靈敏度高，價格低廉，操作方便，結(jié)果客觀，在國內(nèi)實驗室廣泛應(yīng)用，但在工作中遇到的大的問題是出現(xiàn)假陽性的問題。影響因素除了方法學(xué)、試劑盒本身之外,還有標(biāo)本處理、操作不當(dāng)?shù)榷喾N因素，雙試劑兩組結(jié)果進行配對t檢驗，差異（P>0.05）均無統(tǒng)計學(xué)意義。

多種因素可能會導(dǎo)致ELISA法本底偏高。出現(xiàn)灰值，除了嚴格操作、做好質(zhì)控外，對可疑假陽性的標(biāo)本一定要認真復(fù)測。為避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)現(xiàn)將產(chǎn)生假陽性的原因分析如下：

?內(nèi)源性因素

?年齡因素

老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常，產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測的結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

?疾病因素

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內(nèi)含有嗜異性抗體，自身抗體、類風(fēng)濕因子等，這些特殊成分在反應(yīng)過程中有一定的吸附作用，多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性。

?標(biāo)本因素

?標(biāo)本處理不*

血液抽出后未*凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原*析出，加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物，造成洗板不*干凈，酶殘留在反應(yīng)孔中，使反應(yīng)孔吸光度值偏高，出現(xiàn)假陽性，待測血清中混有纖維蛋白原，這種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯空內(nèi)不易洗凈，試驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速（3000/min）和較長的離心時間（>10/min）之上，血液標(biāo)本被充分地離心分離后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入這兩種干擾物質(zhì)對試驗結(jié)果的影響。檢驗醫(yī)學(xué)網(wǎng)

?標(biāo)本溶血

標(biāo)本溶血時細胞內(nèi)液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結(jié)合，洗滌時不易洗去，催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應(yīng)，使本底吸光度值偏高形成假陽性。

?細菌污染

標(biāo)本放置、處置不當(dāng)被細菌污染，一些細菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶會對相應(yīng)的酶做標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾，造成弱的假陽性反應(yīng)。

?操作因素

聚苯乙烯因其具有較長的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA試驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過洗滌清楚在反應(yīng)過程中，非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著試驗的成敗，可以在加樣前離心時得以控制，同樣也可以通過適當(dāng)增加洗滌的次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對試驗結(jié)果的影響，同樣對于血液存在的非特異性的lgG的樣本很難在加樣時將其去除，那么解決的時機就是洗滌過程。

1、加樣太快，加樣時加在孔壁上或有氣泡。

2、底物液反復(fù)使用被污染或被強光照射時間過長。

3、板要平整，尤其是在洗板機洗板的過程中,往往是3排一起洗，如果板不平,就很可能造成洗液有殘留，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈，對實驗結(jié)果造成干擾。

4、洗液溫度 實驗表明:洗液溫度也會影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板”問題，因此，保持在室溫在20-30℃。

5、洗液未注滿孔，孔壁洗滌不干凈也易造成假陽性現(xiàn)象。

6、洗液要新鮮配置，洗液要臨用前新鮮配置，放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或渾濁，造成賭孔導(dǎo)致假陽性。檢驗醫(yī)學(xué)網(wǎng)

7、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成假陽性，孵育時間過長也會造成假陽性;由于樣本較多，加樣后未及時放入孵育箱，反應(yīng)板在室溫呆的時間過長，既間接增加了孵育時間，導(dǎo)致孵育時間過長。

?儀器因素

?酶標(biāo)儀是垂直對反應(yīng)孔比色，反應(yīng)孔底部污染時，出現(xiàn)反應(yīng)孔吸光度值偏高。檢驗醫(yī)學(xué)網(wǎng)

?洗板拖尾現(xiàn)象，洗板機在洗板過程中，出水針出水不暢，滴滴答答不間斷出現(xiàn)水滴，造成板上水過多，拍板不干凈。

?方法學(xué)因素

? 廠家試劑盒，由于不同廠家的診斷試劑所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致，造成靈敏度和特異性不同，因此也造成了假陽性的產(chǎn)生。三代免疫試劑盒只檢測抗體，被某些身體不明抗原干擾，導(dǎo)致的假陽性。

? 實驗灰區(qū)，在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線，作為陽性判定值（cutoff）來判定結(jié)果，一般把檢測值S/COV值在0.6-1范圍內(nèi)時作為灰區(qū)帶，因此當(dāng)1＜S /CO≤0.6時，真反應(yīng)性顯色的可能性小，多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致，實驗室檢測人員應(yīng)依據(jù)實驗檢測結(jié)果，結(jié)合受檢者相應(yīng)病史和個體狀況進行綜合分析，應(yīng)進行確認實驗，避免判定假陽性。

? “鉤狀效應(yīng)”的產(chǎn)生，需對標(biāo)本進行稀釋重復(fù)檢測。

? 酶標(biāo)儀的波長選擇，建議酶標(biāo)儀比色時選擇雙波長，即敏感波長（主波長）和非敏感干擾波長（次波長），后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長與非敏感干擾波長之差，排除（板孔的劃痕、污跡）干擾。