小反芻獸疫病毒檢測(cè)試劑盒-PCR法

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)小反芻獸疫病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對(duì)照為偶蹄獸類基因組DNA，陽性對(duì)照為失去活性的小反芻獸疫病毒cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標(biāo)本類型：發(fā)病動(dòng)物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標(biāo)本采集，方法如下：

(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中，密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物：無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動(dòng)物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè)；若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

 （2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】